中文题名人类5-磷酸磺基-3-磷酸腺苷(PAPS)合成酶的分子遗传药理学
外文题名论文作者许振华
导师周宏灏教授
学科专业药理学
研究领域\研究方向
学位级别博士
学位授予单位中南大学
学位授予日期2001
论文页码总数187页
关键词遗传药理学合成酶磺基化
馆藏号BSLW
中文摘要
遗传药理学是研究遗传因素对药物临床效应和毒副作用影响的一门学科，它对合理个体化用药提供科学依据和理论基矗近年来，随着研究人类基因组的方法和技术迅速发展以及这些方法和技术在这一学科的广泛应用，遗传药理学已逐渐发展为药物基因组学。药物从吸收到发生效应涉及诸多环节，药物临床效应的个体差异可缘于药物吸收分布，药物代谢排泄，药物与靶部位受体的结合和效应等各个环节。然而最为常见的是药物在代谢环节上的个体差异引起药物的临床效能、毒副作用在不同患者之间的显著差异。药物代谢反应总的可以分为两大类：1相药物氧化反应，这类反应主要由细胞色素氧化酶介导2相药物结合反应，包括甲基化、磺基化葡萄糖醛酸化乙酰化和糖苷化，这些结合反应分别由相应的甲基转移酶、磺基转移酶、葡萄糖醛酸化酶、乙酰转移酶和糖苷化酶催化。爱词霸在线词典为广大英语学习爱好者提供腺苷三磷酸酶的意思、腺苷三磷酸酶的解释、腺苷三磷酸酶的翻译、腺苷三磷酸酶发音例句、腺苷三磷酸酶的百科解释,爱词霸英语
磺基化是一类主要的相结合反应，它既参与药物激素、神经递质、前致癌物和其它许多外源性物质的生物转化，它也是大分子蛋白质、碳氢化合物、酯蛋白一个重要的化学修饰过程，对于维持这些大分子的正常生理功能有重要作用。磺基化反应包括多个环节，诸如无机硫酸盐的摄娶转运无机硫酸盐转化为5-磷酸磺基-3-磷酸腺苷PAPS，又称活性磺基PAPS由合成部位转移至高尔基体以及最后由磺基转移酶将磺基由PAPS转移至受体化合物-药物激素、神经递质等。所有磺基化反应的一个先决条件是体内有活性磺基PAPS提供。PAPS由无机硫酸盐和腺苷三磷酸ATP合成而来，PAPS的合成包括两个酶促反应，首先在ATP磺基化酶的作用下，无机硫酸根离子活化并转移至ATP形成5-磷酸磺基腺苷APS。由于APS在细胞基质中极不稳定，它不能作为活性磺基被磺基转移酶利用，APS接着在一激酶的催化下发生磷酸化，最终形成高能化合物PAPS-也就是所有磺基转移酶的共同磺基供体PAPS。在原核生物中，ATP磺基化酶和APS激酶是两个分开的酶蛋白，然而在真核生物中，ATP磺基化酶和APS激酶融合成单一的具有多功能的酶蛋白-PAPS合成酶。PAPS合成酶的羧基端对应于ATP磺基化酶，其氨基端相应于APS激酶，两者之间由一个多肽接头相连接。在体外蛋白表达系统，PAPS合成酶的两个功能区域独立表达时均具有相应的生理活性，但酶蛋白的内在稳定性和催化效率比整体的PAPS合成酶低得多，三磷酸腺苷二钠片这表明ATP磺基化酶和APS激酶的融合是在生物进化过程中出现的有利于细胞功能的改进优势。关键词腺苷三磷酸酶收藏该关键词订阅该关键词各年发文数目2010年度102009年度382008年度年度952006年度年度事实上，由ATP磺基化酶催化的APS生成反应在热力学上是极不利于正向反应进行的，然而PAPS合成酶通过一个通道机制将不稳定的APS及时有效地从ATP磺基化酶的活性中心直接转移到APS激酶的活性中心以生成PAPS，这样既绕过了APS生成过程中的能障，也避免了APS释放到细胞基质中被水解。PAPS的合成是磺基化过程中的一个限速步骤。研究表明低硫酸盐饮食，硫酸盐吸收、重摄取抑制剂，以及需要磺基化进行生物转化和代谢的外源化合物可以导致体内PAPS的供应不足，从而导致体内磺基化代谢速度减慢另一方面，一些遗传突变可导致硫酸盐转运蛋白、PAPS合成酶失活，引起体内PAPS合成缺陷，均影响体内正常的生理功能。至今已有30余种SLC26A2一种硫酸盐转运蛋白，又称DTDST基因突变先后在世界各地的先天性骨骼发育畸形的家系中被发现，这些突变主要引起硫酸盐转运障碍，间接导致PAPS的供应不足，结果对于软骨和骨骼形成至关重要的胶原粘蛋白磺基化不足，三磷酸腺苷片这些有缺陷的病人表现为身材特别矮孝脊椎畸形和关节异常。这些突变对于硫酸盐转运的影响往往很严重，但影响程度仍有些不同，因此这些众多突变引起的临床症状仍有轻重，不同家系中的发育畸形特征也有区别最近，两种PAPS合成酶在小鼠和人类中被先后克隆，它们分别被命名为PAPS合成酶1和PAPS合成酶2PAPSS1和PAPSS2。首先小鼠被克隆，随后我们及其它两家实验室均以小白鼠顺序，对人类表达顺序文库进行搜寻，导致了人类的鉴定和克拢同时另一实验室充分利用一个近亲繁殖的巴基斯坦大家系进行位置克隆，导致的发现和克拢在这个家系中有众多成员患有先天性脊椎发育畸形和四肢短小，三磷酸腺苷连锁分析表明该疾病基因位于10号染色体长臂2区3带至2区4带。借助于EST表达文库，水稻花粉母细胞中的ATP酶反应颗淋少，主要分布在细胞核中。组成花药药壁的4层细胞中只有绒毡层细胞核中有较多的ATP酶。减数分裂后，绒毡层细胞质中分化出许多内质PAPSS2基因被鉴定为该疾病基因。在该家系中，相当于位核苷酸由CA，结果导致多肽链的第475残基由丝氨酸TCA变为一个终止密码子TAA，酶蛋白的翻译过早终止于第475位氨基酸残基而完全失去活性，最终导致软骨形成所需的粘蛋白不能磺基化，患者表现为骨骼系统发育异常类似地，所有文档研究报告医药卫生水稻花药发育过程中腺苷三磷酸酶的分布文档简介水稻花药发育过程中腺苷三磷酸酶的分布文档日志暂无日志信息文档留言暂无留言在小鼠也发现有先天性软骨形成不良的短肢畸形，其相应的PAPSS2基因中存在一错义点突变，导致第79位氨基酸残基由甘氨酸变为精氨酸，由于这一位置上的甘氨酸是一高度保守的氨基酸，对于PAPSS2的PAS激酶活性至关重要，因此这一突变导致了整个酶的活性完全丧失。值得注意的是，在这些患病的病人和小鼠体内PAPSS2完全失活，但体内另一同工酶PAPSS1功能正常。理论上PAPSS1和PAPSS2所催化的底物及形成的产物完全一样，它们在功能上应能彼此互补，然而实际上这两种同工酶各具有独特的功能，彼此在功能上不能替代，这很可能是由于这两种酶在不同组织中的表达有相当选择性或特异性所致。
由于PAPS的合成在磺基化反应中的重要作用，在人群中PAPS合成酶活性的变异可能是磺基化反应个体差异的重要组成部分。研究表明人类磺基化结合反应存在显著的个体差异，磺基转移酶基因中存在的遗传多态性只能解释所观察到的个体差异的部分分子机制。为了查明PAPS合成过程中的分子调节机制，本论文工作对2种已知的PAPS合成同工酶进行了系统的遗药理学研究：
1克隆了人类PAPSS1和PAPSS2基因，查明了其基因结构、组织分布及染色体定位
2建立了一种灵敏的同位素酶促耦联方法测定PAPS合成酶的活性
3研究了肝脏、脑两种重要器官组织中PAPS合成酶的酶促动力学特征，并对肝脏中PAPS合成酶的活性差异进行了测定
4通过对大样本人群进行测序分析，三磷酸腺苷二钠发现了一系列遗传多态性
5将所发现的非同义突变进行体外表达，查明了这些非同义突变对酶功能活性的影响。
一、人类PAPSS1和PAPSS2基因克垄结构特征和染色体定位第一部分
以小鼠作为搜寻顺序，我们从人类EST表达文库搜索到一个来自胎儿脑组织的EST克隆ATCC号码85651，基因库检索号码T09180和T09181，该克隆中的插入顺序与小鼠具有90以上的相似性，表明该克隆的插入顺序很可能是小鼠PAPSS1在人类组织中的对应顺序。测序分析表明该EST克隆只含有PAPSS1核苷酸序列34到2224cDNA序列。为了确定转录起始和终止序列，我们以肾脏cDNA为模板，进行了5-末端和3-末端cDNA顺序快速扩增RACE实验，从而获得了的全长序列。含有60个碱基的5-末端非翻译区以及582个碱基的3-末端非翻译区。编码的氨基酸序列与小鼠PAPSS1具有986的相似性。PAPSS1共有624个氨基酸，其分子量约为709kDa。我们克隆的基因检索号码为AF105227。
在我们克隆和基因的过程中，另一人类PAPSS同工酶PAPSS2被克隆，的克隆基于另一不同的克隆策略如前所述，位置克隆将一个近亲繁殖的巴基斯坦先天性软骨发育不良的家系疾病基因定位到10号染色体长臂2区3带到4带，借助于人类EST文库，PAPSS2基因被鉴定为该家系中出现的先天性软骨发育不良的致病基因，同时其cDNA顺序以及引起该疾病的遗传突变机制已被查明。这些突变使酶完全失活，但是对于正常人群中该基因顺序中的遗传多态性至今没有报道，通常这些遗传多态性应当不致使酶蛋白完全失活，但可能显著地改变酶的活性和功能性质，从而导致人群体内磺基化反应的个体差异以及对一些疾病的遗传易感性的差异。作为对PAPSS1和PAPSS2进行遗传药理学研究的一步，我们首先克隆了编码这两种PAPS合成酶的基因。我们以PAPSS1和PAPSS2的cDNA序列分别同位素标记作为探针，三磷酸腺苷注射液应用Southern分析人类基因组细菌人工染色体BAC文库，分离出含有PAPSS1和PAPSS2基因的BAC克拢由于PAPSS1和PAPSS2的长度很长，从多个BAC克隆中的插入顺序我们才获得了PAPSS1整个基因。幸运的是PAPSS2全长基因包含在一个BAC克隆中说明：利用染料亲和层析柱和WCX弱离子交换柱对200对长角血蜱唾液腺进行腺苷三磷酸双磷酸酶纯化。结果经第一步纯化,腺苷三磷酸双磷CJFD2002对所获得的BAC克隆直接测序，我们获得了所有外显子-内含子剪接连接处的碱基序列。通过长序列扩增，我们获得了各内含子的大致长度。然而对于PAPSS2内含子1，尽管我们采用了多种努力，仍未能成功扩增这个内含子，我们推测PAPSS2内含子1的长度可能超过至少20kb或者其碱基序列的特殊性使PCR难以扩增这一段DNA序列。结果显示PAPSS1和PAPSS2具有十分相似的基因结构，它们都含有12个外显子，除了PAPSS2外显子2比PAPSS1外显子2多编码1个氨基酸酸残基外，其它所有外显子-内含子剪接部位全部相同。PAPSS1基因的长度约为108kb，而PAPSS2基因至少为37kb。PAPSS2基因转录起始点上游21bp处有一TATA基序，但PAPSS1基因上游区域没有典型的TATA、CCAAT或者Inr启动基序。但无论PAPSS1基因或者PAPSS2基因的5-侧翼区均含有包括Sp1Sp2、Ap1、Ap2等转录因子结合的DNA基序，它们的3-非翻译区都含有转录终止信号-多聚腺苷酸信号顺序AATAAA。Northern杂交分析表明长度约为22kb。由于含有一个较长的3-非翻译区和多聚腺苷酸尾，因此的长度远较其开放读码框架长。广泛表达于人体内各种组织中尤其在脑、脊髓支气管、前列腺和睾丸中的表达水平为高相反，人类PAPSS2只选择性地在一些组织器官中表达，它在人体肝脏肾上腺、小肠和卵巢中的表达水平较高，但在人脑中PAPSS2表达水平很低ATP酶，又称为三磷酸腺苷酶，是一类能将三磷酸腺苷ATP催化水解为二磷酸腺苷ADP和磷酸根离子的酶，这是一个释放能量的反应。在大多数情况下，能量可以通过基于PCR及荧光原位杂交FISH，PAPSS1基因被定位于4号染色体长臂2区4带4q24，PAPSS2位于10号染色体长臂2区2带至2区3带10q22-23。人类PAPSS1和PAPSS2基因克隆和结构特征为对其进行遗传药理学研究提供了基础，使我们有可能利用其内含子序列设计基因特异的引物扩增所有外显子、外显子和内含子剪接部位以及潜在的启动子区域，从而通过PCR产物直接测序鉴定存在于这两个基因中的遗传多态性变异。
二、人类PAPS合成酶活性测定方法的建立、PAPS合成酶的生化性质和肝脏中PAPS合成酶的活性差异第二部分
