贾恩志,南京医科大学第一附属医院心内科江苏省南京市210029
李爱香徐振霞,山东省济宁市第二人民医院急诊科山东省济宁市272049
贾恩志男生,山东省济宁市人汉族2003年南京医科大学心血管专业博士研究生毕业讲师,主治医师,主要从事冠心病与胰岛素抵抗的研究
国家自然科学基金资助课题通讯作者:贾恩志210029,江苏省南京市广州路300号,南京医科大学第一附属医院心内科电话收稿日期接受日期本实验室成功的研制出了一种能够自乳化的稳定的胰岛素口服制剂,为实现蛋白质多肽药物的口服给药提供了新的载体。本论文对该制剂进行了较系统的体外研究,主要包括检测胰岛素注射方法摘要目的:建立灵敏、特异的检测人血清中胰岛素原的酶联免疫吸附试验并应用于临床与流行病学研究方法:选择2种mAb并引入生物素与亲和素放大系统来建立酶联免疫分析Abstract
摘要目的:建立灵敏、特异的检测人血清中胰岛素原的酶联免疫吸附试验并应用于临床与流行病学研究
方法:选择2种mAb并引入生物素与亲和素放大系统来建立酶联免疫分析方法，一种抗C肽mAb结合到酶反应板上作为固相抗体，另一种生物素标记的抗胰岛素抗体作为液相抗体，将该检测方法应用于流行病学研究结果:本法灵敏度与胰岛素、肽无交叉反应，线性标准范围批内变异系数小于114%，胰岛素使用方法批间变异系数小于11流行病学研究结果显示胰岛素原的含量与体重指数腰围、收缩压舒张压、胆固醇三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇、危险因素数目呈正相关，与高密度脂蛋白胆固醇呈负相关
结论:本法适用于在临床研究及流行病学研究中检测人血清中胰岛素原的含量b细胞功能受损与纤溶功能的紊乱可能是高胰岛素原与心血管危险因素关联的原因
关键词:单克隆抗体;胰岛素原;危险因素聚集
贾恩志李爱香,徐振霞单克隆抗体酶联免疫方法检测人血清胰岛素原及其应用世界华人消化杂志0引言胰岛素原，PI)是胰岛素的前体物质，由胰岛b细胞分泌，在正常情况下外周循环中的PI占总胰岛素样物质的比例较小，但是在糖尿病[1]、冠心病[2]等情况下PI呈现与胰岛素不呈比例的高分泌状态流行病学及临床研究证实外周循环中的PI的浓度与中风[3]、高血压[4]及其他心血管危险因素[5]有较为密切的关系因此快速、灵敏、特异地检测外周循环中的PI已经成为心脑血管疾病及内分泌疾病研究的必需我们应用2种mAb建立了经生物素-亲和素放大系统的酶联免疫吸附实验方法来检测PI并应用于临床检测及流行病学研究
1材料和方法
11材料PEP-001与由丹麦公司馈赠，分别由人C肽(PEP-001)、人胰岛素(HUI-001)免疫BALB/c小鼠并且应用杂交瘤技术获得抗体获得后应用蛋白A-亲和层析柱纯化后备用PEP-001抗体与人C肽的亲和力为1010L/mol，结合位点在其C末端的中部，HUI-001与人胰岛素的亲和力为109L/mol，结合位点为胰岛素B链的C端[6]4mg长臂生物素，溶于1mL二甲基甲酰胺并取60mL加入，在室温中轻微振荡混匀4h生物素化的mAb注入透析卡在PBS缓冲液中透析过夜去离子水由Minipore系统生产来配置缓冲液与试剂缓冲液A(包被缓冲液)为01mol/L的碳酸盐缓冲液pH值为9缓冲液B(冲洗液)为的氯化钠缓冲液包含1mL/L的Tween20缓冲液C(封闭液)为05g/L的牛血清白蛋白缓冲液D被用来温育标记抗体和稀释亲和素为004mol/L的磷酸盐缓冲液加入01mol/L的氯化钠、5g/L的人血清白蛋白(由上海生物制品研究所提供)，pH值为7缓冲液E(抗原温育液)为004mol/L的磷酸盐缓冲液加入10mol/L的氯化钠、30g/L人血清白蛋白(由上海生物制品研究所提供)、1g/L的牛g球蛋白、1mL/L的Tween20pH值为7辣根过氧化物酶标记的链球菌亲和素为美国实验室提供，产品编号为14-30-00，加入500mL/L甘油1mL溶解亲和素05mg并在-20保存，在使用前应用缓冲液D进一步稀释成25mg/L底物液为四甲基联苯胺/双氧水溶液系统(33，5，为美国KPL实验室提供，产品编号为50-76-00，使用前两种溶液等量混匀酶标板为丹麦NUNC公司产品，酶标仪为美国Bio-Tek产品，型号为EL900PI标准品为瑞典Mercodia产品，该标准品由国际人PI参考试剂校正
按照随机分层抽样的原则，在江苏省邳州市随机抽取4个乡镇，每个乡镇随机抽取1个村庄，每个村庄随机抽取350名35-59岁的常住居民，抽样1400人，调查人数1265人，有效样本量为1196人男533人，女663人，平均年龄46测量身高(HTcm)、体重(WHkg)、腰围(WCcm)、收缩压(SBP)与舒张压(DBP)按照体重(kg)/身高(m2)计算体重指数(BMI)全部研究对象空腹检测血糖(FBGmmol/L)、总胆固醇(TCHmmol/L)、甘油三酯(TGmmol/L)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLmmol/L)，所用仪器为全自动生化分析仪，胰岛素泵使用方法试剂为日本第一化学株式会社供应，检测符合实验室质控标准低密度脂蛋白胆固醇(LDL，mmol/L)按公式计算求得全部血清标本-20保存，分批检测PI
12方法包被抗体(PEP-001)在缓冲液A中被稀释成5mg/L并在酶标板每孔中加入125mL，密封后4温育3d，然后弃去抗体，冲洗液洗涤4次胰岛素抵抗的检测方法很多，按设计原理大致分为三类1开环法：即阻断内源性葡萄糖与胰岛素反馈环法，如正常葡萄糖高胰岛素钳夹技术、胰岛素抑制试验。2#加入200mL封闭液密封过夜在使用前洗涤液洗板4次，每孔加入缓冲液E50mL，然后各加入标准品、质控液、标本50mL(皆双孔重复)，反应板被密封后4过夜生物素标记的HUI-001在缓冲液D中被稀释成25mg/L，过夜后的反应板被冲洗4次并每孔加入稀释后的，反应板被密封后4过夜反应板被冲洗4次后加入新鲜配置的辣根过氧化物酶标记的链球菌亲和素100mL并室温避光反应1h，冲洗4次后每孔加入底物液125mL，胰岛素的注射方法避光室温反应30min后每孔加入125mL的4mol/L的磷酸终止反应在酶标仪上使用450/620nm双波长读取吸光度值定义高血压为:收缩压140mmHg和/或舒张压90mmHg;正在服用抗高血压药[7]定义高血糖:空腹血糖被确诊的糖尿病患者[8]将高胆固醇定义为高低密度脂蛋白胆固醇定义为高甘油三酯定义为低高密度脂蛋白胆固醇定义为将定义为超重[10]将向心性肥胖定义为男性腰围85cm;女性腰围80cm[11]将上述危险因素进行记分，分别研究PI在人群中的分布及与各变量、危险因素聚集的关系全部使用美国SPSS100软件完成
21方法学评价浓度为0，32，12，46，142pmol/L的标准品的吸光度值分别为0295，由于工序多,周期长,各步缺少中间检测的方法,这给胰岛素的质量控制带来较大的困难。目前,免疫沉淀法已被广泛地应用于蛋白质的定性、定量分析。单向免疫火箭电泳是六0568与2679，胰岛素抗体检测方法和临床意义文章发布者：来源：寻医问药网收藏本文1、胰岛素抗体生化特征与病理生理作用1983年Banting发现用胰岛素治疗的糖尿病人血清中存在抗胰岛素进行3次方的曲线拟合其决定系数(R2)为1，说明拟合较好建立的方程为浓度吸光度-97786吸光度2+70687吸光度3每次检测均利用标准品建立个回归方程以10次检测的0标准的均值加2个标准差为与的真胰岛素、的C肽无交叉反应胰岛素原浓度为32，胰岛素检测12，46，142pmol/L的标准品批间重复10次的变异系数分别为114%，胰岛素抵抗(IR)是近年研究的热点,为此往往要求定量地检测IR或胰岛素敏感指数(ISI,即IR的倒数)。检测IR的方法很多,现作一简单复习[1]。IR是指一定量胰岛素的生物824%;浓度为142，的标本批内重复8次的变异系数分别为1155%与5分别在胰岛素原含量为0，146与的标本中加入浓度为30，420与的标准品，其回收率(%)见表1分别取6份胰岛素含量相对高的标本倍比稀释，结果显示测得值与期望值非常接近(表2)
