谷氨酸脱羧酶自身抗体对胰岛素分泌的影响王
中华内分泌代谢杂志1998年第3期第0卷论著
作者：建民周智广伍汉文
单位：410011长沙湖南医科大学代谢内分泌研究所
关键词：1型发病机理谷氨酸脱羧酶自身抗体
摘要目的探讨1型糖尿病胰岛素缺乏机理及GAD-Ab对胰岛细胞结构及功能的影响。方法以改良的放射配体法筛选1型糖尿病患者GAD-Ab阳性血清，以亲和层析法从该血清中分离纯化GAD-Ab，以免疫荧光法观察GAD-Ab与-细胞的结合将纯化的GAD-Ab及/或补体加入人胎胰岛细胞培养体系。干细胞胰岛素结果GAD-Ab能够与-细胞结合，并使培养胰岛细胞的胰岛素释放量减少透射电镜观察，加GAD-Ab组-细胞胞浆颗粒减少同时加入补体组-细胞的细胞膜被破坏。结论1型糖尿病患者血清GAD-Ab在体外能够抑制培养的人胎胰岛-细胞的胰岛素合成和释放，并且有补体依赖性细胞毒作用。
昨天我去复查了，抗酪氨酸磷酸酶抗体和抗胰岛细胞抗体还是阳性。我不是在一家医院查的。我想根据您的建议开始用胰岛素治疗，根据我现在的情况您建议用量多少？：168-171)
1型糖尿病是一种器官特异性自身免疫性疾玻已经发现的自身抗体有胰岛素自身抗体(IAA)、胰岛细胞抗体(ICA)、胰岛细胞表面抗体(ICSA)和谷氨酸脱羧酶自身抗体(GAD-Ab)等二十多种然而，请问谷氨酸脱羟酶抗体GADA、胰岛细胞抗体I-CA和胰岛素自身抗体IAA，检查这三个要多少钱，为什么医生没给我化验啊，只让我做了糖耐量和馒头餐。这些抗体是胰岛细胞破坏的原因还是结果，至今仍无定论。GAD-Ab是近年来发现一种新的1型糖尿病自身抗体，可在绝大多数初发1型糖尿病患者和高危人群中检出，标记免疫分析与临床年月第第期卷胰糖尿病糖尿病检测谷氨酸脱羧酶抗体、胰岛细胞抗体和胰岛素自身抗体的临床意义文档日志在1型糖尿病动物模型(非型糖尿病倾向小鼠，即NOD小鼠)的众多自身抗体中出现最早、对1型糖尿病的诊断及预报价值最高因而，多数学者认为GAD是1型糖尿病的始动抗原，从而受到越来越多的关注1-3。为了探讨人GAD-Ab对人胰岛细胞的作用，本文用纯化的人和人胎胰岛细胞进行研究结果表明，GAD-Ab在体外能够破坏人胎胰岛细胞的结构和功能，造成胰岛素缺乏。现报告如下。
材料和方法
一、谷氨酸脱羧酶自身抗体检测
参考Petersen等4的方法并加以改良简述如下。
1试管内转录和翻译生产标记抗原(35S-GAD)。转录体系内主要含T7RNA多聚酶及NTP等，依照供货商(Promega)提供的反应条件进行试管内转录和翻译35S-GAD标记抗原。胰岛素抗体37孵育1小时，再加热至6710min，随后冷存备用。胰岛素自身抗体翻译体系含无蛋氨酸的兔网织红细胞裂解液2gdNA，35S-蛋氨酸08mCi/ml，总反应体积50l。用溶液含二巯基苏糖醇(DTT)，1mM磷酸吡哆醛05%牛血清白蛋白pH=74将翻译物35S-GAD65稀释至450l过NAP5柱，100l一份，收集后用作GAD-Ab检测的示踪剂。
2放射配体分析法(RLA)检测谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab)：将待测血清用吐温20pH=72稀释后与上述制备(试管内转录和翻译)的35S-GAD一起，在管中4孵育过夜后，每管加入75mg蛋白A琼脂糖凝胶再4孵育，轻摇2小时。用TBST洗3次，弃上清留沉淀，加闪烁液1ml/管，液闪仪测cpm，每份样品均做2管，标准对照(阳性和阴性)做4管阳性判断标准：样品cpm值正常对照均值+2个标准差被认为是阳性。
二、亲和层析分离纯化从1型糖尿病患者中筛选出GAD-Ab阳性，胰岛素抗体和ICA阴性之血清样本作为的来源。酶免法测ICA，依照试剂盒的使用说明进行。放免法测胰岛素抗体(华西医科大学糖尿病科技开发研究所试剂盒)。自制蛋白A凝胶柱(1ml)，连接于快速蛋白质液相层析仪(FPLC，进行亲合层析。将血清离心10000rpm,胰岛素抗体阴性10min用甘氨酸氢氧化钠30M氯化钠pH=89)将样品稀释1倍。用悬浮蛋白A凝胶(美国生命技术公司)装柱。设定液体流速为05ml/min，检测波长280nm。用5倍柱体的Buffera平衡柱体。每次上样500l。用枸橼酸氢氧化钠pH=40)洗脱。每管收集3min，每支管内预先加含。用BufferC(含01M枸橼酸氢氧化钠pH=30)将柱体清洗至基线回恢复零位正胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)被认为是与遗传有关的自身免疫性疾玻这类患者血清中常存在多种自身抗体,检测胰岛素抗体(IAb)、胰岛细胞抗体(ICA)对IDDM自身免疫UV)用Buffera平衡柱体，开始下一个层析周期。
三、补体制备
取出生后第3周的日本大耳白幼兔心脏采血，无菌操作37保温，血凝后离心，胰岛素的靶细胞取上清过滤除菌多份混合，测补体效价单位，-60冻存备用。
四、胰岛细胞培养
参考胡远峰等报告的方法5简述如下。取水囊引产胚胎，娩出后立即无菌取胰，去除胰外组织液清洗，剪成12mm3之碎片洗3次，加入V型胶原酶，38水浴中振荡消化810分钟，用冷培养液终止消化，如此反复消化数次，直至完全消化分离、洗涤消化物，用培养液制成细胞悬液。细胞培养液为RPMI1640，含15%灭活新生牛血清，10mM烟酰胺，1mM丙酮酸钠，8mM碳酸氢钠，100u/ml青霉素，100g/ml链霉素pH72。置CO2培养箱37，95%空气5%CO2，饱和湿度，培养24小时后转皿，48小时后碘乙酸处理，隔日换半量培养液，倒置显微镜观察。放免法测胰岛素(华西医大糖尿病科技开发研究所试剂盒)。
五、间接免疫荧光法观察GAD-Ab与胰岛细胞结合
将分离的人胎胰岛细胞悬液涂于玻片上空气干燥，甲醛固定，加GAD-Ab(阳性血清分离出之IgG)，对照组加正常人和IAA均阴性者)37，饱和湿度，反应30分钟，洗涤后再加羊抗人IgG荧光抗体(军科院微生物流行病研究室)反应30分钟，洗涤后荧光显微镜(Nikon)观察。
六、检测GAD-Ab对胰岛细胞胰岛素分泌功能的影响
将培养第7天的胰岛细胞更换液体，先用低糖(葡萄糖，病情描述主要症状、发病时间：200812曾经治疗情况和效果：用拜糖平及增敏剂想得到怎样的帮助：现在血糖控制正常范围内，我想知道我的胰岛素细胞是不是继续衰竭56mmol/L，上海试剂二厂)培养液孵育2小时，换液并加GAD-Ab及补体，孵育2小时然后再换液，加含高糖和茶碱的(10mmol/L，上海试剂二厂)的培养液，37孵2小时，每次加入新培养液之前均用液洗3次，取培养上清测胰岛素含量。实验分组见附表。
七、透射电镜观察培养胰岛细胞的结构变化
八、统计学处理：双侧性t检验比较不同实验组之间的胰岛素分泌量之差别。
结果
一、一份试管内翻译反应在凝胶过滤纯化后的常规定量为，可进行80100份放射配体分析(RLA)。应用不同的阳性血清分析结果显示，本分析方法的组内变异为68%组间变异为81%。以样品cpm值大于对照组cpm均值+2s为阳性标准，15例初发1型糖尿病中有10例阳性，占67%。
二、蛋白A凝胶亲合层析纯化具有较高的纯度，连接于FPLC后是快速方便的有效方法。每毫升血清可纯化出35mgigG纯度为873%，只含微量的IgM(32%)和IgA(56%)。探讨血清谷氨酸脱羧酶抗体GAD-Ab、胰岛细胞抗体ICA和胰岛素自身抗体IAA检测对糖尿病DM的临床意义。对46例1型糖尿病DMl、78例2型糖尿病DM2
三、免疫荧光分析结果显示，GAD-Ab能够与胰岛细胞结合，荧光显微镜下胰岛细胞团发出较强的黄绿色荧光。
四、培养体系中单独加入GAD-Ab(C组)，可使高糖和茶碱刺激的培养胰岛细胞的胰岛素释放量平均减少38%GAD-Ab作用后再加入补体(D组)，可使其胰岛素释放量更加明显地减少，达60%(参见附表)。
附表GAD-Ab对人胎胰岛细胞胰岛素分泌功能的影响
